血清脂蛋白电泳原理和操作方法
血清脂蛋白,当前在临床应用方面,它的作用还是比较大的,所以对于很多的患者,就想全面了解一下血清脂蛋白电泳原理和操作方法,为了你能尽快的了解,下面内容就做了详细的介绍,你可以充分的了解一下,相信会对自己以后有帮助.
原理
脂蛋白是在碱性pH条件下,以琼脂糖凝胶或醋酸纤维条带作为载体,从阳性方向来进行分离的。形成的蛋白区带可以用脂肪染料如苏丹黑或者油红染色,它们只用于脂蛋白染色。在琼脂中可能会有附加的聚阴离子和二价阳离子沉淀。脂蛋白沉淀带用光密度计可立即定量分析。脂蛋白区带也可以被切开后重新溶解,对各区带进行胆固醇浓度的直接酶法检测。另外,有报道在用薄层琼脂糖凝胶上进行电泳分离后,可直接检测各脂蛋白组分中的胆固醇含量的方法。
操作方法
(1)将缓冲液加入电泳槽内,调节两侧槽内的缓冲液,使其处于同一平面。
(2)醋酸纤维素薄膜的准备:取醋酸纤维素薄膜(2cm×8cm)在毛面的一端(负极侧)1.5cm处用铅笔轻划一横线,做点样标记。编号,并标明正、负极后,将薄膜置于巴比妥-巴比妥钠缓冲液中浸泡,待充分浸透后(一般为20min)取出,夹于洁净滤纸中间吸去多余的缓冲液。
(3)将醋酸纤维素薄膜毛面向上贴于电泳槽支架上拉直。用微量吸管吸取无溶血血清3~5μl于横线处沿横线加样,样品应与薄膜的边缘保持一定的距离,以免电泳图谱中的蛋白区带变形,待血清渗入薄膜后,反转薄膜,使光面朝上,平直地贴于电泳槽支架上,用双层滤纸或四层纱布将薄膜的两端与缓冲液连通,稍待片刻。
(4)接通电源,注意醋酸纤维素薄膜上的正、负极,切勿接错。电压90~150V,电流0.4~0.6mA/cm(不同的电泳仪所需电压,电流可能不同,应灵活掌握),夏季通电45min,冬季通电时间稍长,约为60min,电泳区带展开约25~35mm即可。
(5)染色:通电完毕,取下薄膜直接浸于丽春红S染液或氨基黑10B染色液中,染色5~10min(以白蛋白区带染透为止),然后在漂洗液中漂去剩余染料,直至背景无色为止。
(6)定量:
①比色法:将漂洗的薄膜吸干,剪下各染色的蛋白区带入相应的试管中,在白蛋白管中加0.4mol/L氢氧化钠6ml(计算时吸光度乘以2),其余各管加3ml,振摇数次,置37℃水箱20min使其色泽浸出。氨基黑10B染色用分光光度计在620nm处读取各管吸光度,然后计算出各管的含量(同时做空白管对照)。
丽春红S染色时浸出液用0.1mol/L氢氧化钠,加入量同上法。10min后,白蛋白管内加400ml/L醋酸0.6ml(计算吸光度时乘以2),其余各管加0.3ml,以中和部分氢氧化钠,使色泽加深,必要时离心,取上清液用分光光度计在520nm处读取各管的吸光度(同时作空白对照),然后计算各自的含量。
②光密度计扫描法:A.透明:吸去薄膜上的漂洗液(为防止透明液被稀释影响透明结果),将薄膜浸入透明液中2~3min,然后取出,以滚动的方式平贴于洁净无划痕的载物玻璃片上(切勿产生气泡),将此玻片竖立片刻,除去多余透明液后,置于恒温90~100℃的烘箱内,烘烤10~15min,取出冷却至室温,用此法透明的各蛋白区带鲜明,薄膜平整,可供直接扫描和永久保存(用氢萘或液体石蜡透明,应将漂洗过的薄膜烘干后进行透明,此法透明的薄膜不能存久,且易发生皱折)。②扫描定量:将已透明的薄膜放入全自动光密度计或其他光密度计暗箱内,进行扫描分析。
血清脂蛋白电泳原理和操作方法,本篇的内容就为很多的患者,做了详细的介绍,所以要想全面的了解,可以通过以上的介绍,具体的了解一下它的原理,以及操作的方法,相信通过了解,就能具体对原理和操作方法有一个充分的认识。
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